Gli effetti dell’esposizione a elementi neurotossici sul comportamento degli alunni italiani

Riassunto

Traduzione a cura di VeraLeaks – I disturbi neurocomportamentali sono in costante crescita su scala globale. Alcuni elementi come i metalli pesanti sono conosciuti per essere neurotossici. In questo studio a sezione trasversale abbiamo definito l’effetto neurocomportamentale dell’esposizione per tracciare gli elementi, inclusi il piombo, il mercurio, il cadmio, il manganese, l’arsenico e il selenio e le loro interazioni tra i 299 studenti che vivono nella zona pesantemente inquinata di Taranto. Tutti i campioni di sangue, urina e capelli sono stati raccolti per le analisi dei metalli, mentre la Checklist sul Comportamento Infantile e la Social Responsiveness Scale (SRS), somministrati alla principale insegnante e alle madri, sono stati considerati per identificare i problemi comportamentali nei bambini. Il piombo nel sangue ha influenzato principalmente i problemi sociali, il comportamento aggressivo, l’esternalizzazione e i problemi totali. L’arsenico nelle urine ha mostrato un impatto sull’ansia e la depressione, sui problemi somatici, sui problemi di attenzione e sul comportamento di violazione delle regole. È stata osservata un’interazione significativa tra il piombo e l’arsenico, con un effetto sinergico dei due metalli che aumenta il rischio dei problemi di attenzione, comportamento aggressivo, problemi di esternalizzazione e problemi totali. In generale, siamo stati in grado di sperimentare che più alte concentrazioni di piombo nel sangue, di arsenico nelle urine e le loro interazioni aumentano il rischio di problemi neurocomportamentali. Questo è in linea con la lista di priorità delle sostanze pericolose dell’Agenzia di Protezione Ambientale negli U.S. in cui l’arsenico e il piombo sono classificati al primo e secondo posto rispettivamente.

Introduzione

I disturbi del neurosviluppo, inclusi l’autismo, il Disturbo da Deficit di Attenzione Iperattività (ADHD), le disabilità di apprendimento e comportamento, colpiscono il 10-15 % delle nascite1 e sono in costante crescita su scala globale 2. Risultati simili sono stati osservati sui bambini negli Stati Uniti3. In due regioni del Centro Italia, circa l’1.3 % dei bambini italiani nelle classi elementari e medie hanno presentato forme severe di ADHD4. Secondo le statistiche sull’incidenza dell’autismo dai Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie (CDC), un bambino ogni 6-8 soffre di disturbi dello spettro autistico negli Stati Uniti5. Un confronto sulle tendenze globali ha mostrato che la prevalenza di diagnosi di autismo è cresciuta drammaticamente negli Stati Uniti negli ultimi decenni, soprattutto dagli anni Ottanta, e continua a salire. La prevalenza media in Asia, Europa e Nord America varia tra l’1 e il 2% 6. Questi dati hanno mostrato un aumento decuplo negli ultimi 40 anni sul fatto che il 3% delle disabilità dello sviluppo siano una conseguenza dell’esposizione ambientale a sostanze neurotossiche e un altro 25% dell’interazione tra pericoli ambientali e predisposizione genetica individuale 7,8. Gli agenti tossici mostrano delle tendenze che si correlano in positivo sull’aumenti dell’autismo 9. Elementi neurotossici inclusi il piombo (Pb), mercurio (Hg), cadmio (Cd), manganese (Mn) e arsenico (As) sono noti per essere in grado di attraversare la placenta attraverso variazioni di sequenza che possono colpire il metabolismo delle proteine e il trasporto dei metalli 10 e di attraversare la barriera ematoencefalica e interferire con i neuroni 11,12 mentre il selenio (Se) è un potenziale agente protettivo per la difesa metabolica contro lo stress ossidativo, nonostante il suo margine di sicurezza è piuttosto ristretto 13,14. Diversi studi sui bambini esposti a livello ambientale a questi elementi hanno mostrato impatti sull’attenzione e sul comportamento e la prestazione scolastica 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Alcuni lavori che esplorano gli effetti comportamentali dell’esposizione alla miscela di metalli hanno trovato un effetto nocivo aumentato 27,28,29,30. Comunque, data la complessità del problema servono maggiori evidenze sull’effetto sinergico dell’esposizione ai metalli sul neurocomportamento. Il meccanismo esatto neurotossico con cui una miscela di metalli, inclusi il Pb, Hg, Cd, e As, può portare a problemi del comportamento è ancora incerta e c’è bisogno di maggiore ricerca e evidenze su come le miscele di metalli e le interazioni tra le sostanze chimiche possano influenzare il comportamento 31.

In questo studio abbiamo definito l’effetto neurocomportamentale dell’esposizione ad alcuni elementi, tra cui Pb, Hg, Cd, Mn, As e Se, sui bambini tra 6-11 anni che vivono nella zona pesantemente inquinata di Taranto, considerando le interazioni tra gli elementi che mostrano una significativa associazione con gli sviluppi comportamentali.

Risultati

La tabella 1 mostra le complessive caratteristiche sociodemografiche dei partecipanti, raggruppati anche per area di residenza. Due dei quartieri più vicini al sito industriale (Tamburi e Paolo VI) erano caratterizzati da una percentuale più bassa di status socioeconomico di alto livello (SES) (1.3 % e 0 % rispettivamente, Chi-quadrato valore p < 0.001), una più alta frequenza di esposizione al fumo passivo (26.9 % e 11.1 rispettivamente, Chi-quadrato valore p < 0.001) e un più basso quoziente intellettivo (IQ) (mediana IQ uguale al 94 e 102 rispettivamente, rapportato a 110 nei quartieri di Statte e Talsano, Kruskall-Wallis valore p < 0.001) I bambini che vivono a Tamburi hanno mostrato uno stimolo cognitivo più basso a casa (mediana (1Q-3Q) punteggio totale HOME uguale a 5.0 (4.0, 6.0), Kruskall-Wallis valore p < 0.001), erano leggermente più anziani e avevano una percentuale di femmine più alta dei bambini che vivono lontani dalla fonte.

Tavola 1 Caratteristiche sociodemografiche complessive e stratificate per area di residenza

Le concentrazioni di metallo hanno mostrato una bassa inter-correlazione (Tavola S1 del Materiale Supplementare) con il valore più alto pari a 0.276 corrispondente alla correlazione tra urine As (UAs) e capelli Hg (HHg).

Dopo aver controllato il presupposto di una relazione lineare attraverso delle spline cubiche (dati non mostrati), abbiamo osservato una tendenza negativa di concentrazioni di metallo aumentando la distanza dalla fonte di esposizione (Tavola 2). Solo HHg e Se nel sangue (BSe) hanno presentato un’associazione positiva.

Tavola 2 Statistiche descrittive dei biomarcatori.

È stata trovata poca concordanza tra le valutazioni dei genitori e degli insegnanti (ICC a partire da 0.06 per problemi di ansia a 0.36 per problemi di condotta) mentre l’asimmetria e la curtosi hanno evidenziato una distribuzione non-normale della sindrome basata empiricamente di livello più basso e le scale orientate DSM (asimmetria e curtosi sopra 0.5 e 3 rispettivamente per tutti questi esiti). Le Tavole 3 e 4 mostrano la mediana e il primo e terzo quartile dei punteggi neurocomportamentali incluso il CBCL basato empiricamente e le scale orientate DSM riportate dai genitori e dagli insegnanti rispettivamente. I punteggi più alti indicano livelli di problemi più alti in un’area, cioè una prestazione migliore nelle aree più lontane, mentre i punteggi più bassi indicano meno problemi. È riportato anche il valore p della Kruskal-Wallis.

Tavola 3 Scale CBCL di genitore totali e divise per area e punteggio totale SRS.

Tavola 4 Scale CBCL di insegnante totali e divise per area e punteggio totale SRS

Abbiamo trovato differenze significative tra le aree di residenza per problemi sociali, problemi di esternalizzazione, problemi di disordine ribelle oppositivo e il punteggio totale SRS riportato dai genitori mentre per le valutazioni degli insegnanti c’era una significativa differenza in tutti i punteggi a parte i problemi di pensiero, problemi di attenzione, problemi affettivi, problemi di ADHD e problemi di disordine ribelle oppositivo. In generale, siamo in grado di vedere valori di punteggio più alti per le aree più vicine alla fonte di emissione rispetto a quelle a maggiore distanza.

È stata eseguita un’analisi di multicollinearità quando sono stati applicati modelli multivariabili: bassi VIF sono stati osservati per tutti i modelli adatti a ogni risultato (tutti i VIF < 5). Gli effetti marginali degli elementi neurotossici e il 95 % CI della regressione censurata per le sub-scale CBCL sono mostrate nella Tavola 5 (sono mostrati solo i risultati significativi). Un’associazione positiva significativa è stata trovata tra il Pb del sangue (BPb) e i problemi sociali e le scale di comportamento aggressivo mentre UAs hanno un maggiore impatto sulle scale dei disturbi somatici, di ansia depressione, di problemi di attenzione e di comportamento di violazione delle regole. Gli effetti stimati di ogni modello erano al netto di sesso, età, SES, distanza dalla fonte, IQ, esposizione al fumo passivo e punteggio totale di HOME. Nella Tabella 5 sono anche riportati i risultati di modelli lineari a effetto misto. In questo caso solo BPb ha un impatto statisticamente significativo sulle scale di CBCL di esternalizzazione e dei problemi totali, mentre UAs ha un’associazione marginalmente significativa con i problemi totali e il punteggio totale di SRS. In questo caso i modelli sono stati aggiustati per le stesse covariate delle prime, ma gli effetti random hanno permesso di considerare la struttura impilata dei dati (materie, scuole e aree di residenza). In generale, siamo stati in grado di provare che concentrazioni più alte di BPb e UAs sono associate con maggiori problemi neurocomportamentali. Tutti gli altri elementi non sembravano avere un’associazione statisticamente significativa con il neurocomportamento dei bambini. Le correlazioni semi-parziali applicate a modelli multi-variabili hanno confermato i risultati ottenuti e mostrati nella Tabella 5 e 6 che presentano più alti R2 per BPb quando si considerano i problemi sociali, comportamento aggressivo, esternalizzazione e problemi totali come variabili dipendenti mentre le UAs hanno significativamente aumentato la quantità spiegata di variabilità di disturbi di ansia e depressione, disturbi somatici, problemi di attenzione e comportamento di violazione delle regole (la proporzione della varianza spiegata associata a BPb e UAs era maggiore del 7% in tutti questi casi).

Tavola 5 La regressione Tobit e il modello lineare a effetto misto per provare l’associazione chimica neurotossica con i punteggi CBCL SRS.

Tavola 6 Associazione tra BPb e UAs interazione ed esternalizzazione e problemi totali e punteggio totale SRS.

Abbiamo infine introdotto i termini di interazione tra le paia di metalli ma solo BPb e UAs hanno mostrato un effetto sinergico sul comportamento infantile. La figura 1 mostra gli effetti dell’interazione tra BPb e UAs sul comportamento aggressivo e sui problemi di attenzione: per entrambi i metalli possiamo vedere valori più alti sul parametro β per concentrazioni superiori di metallo, inoltre l’effetto diventa significativo per livelli superiori di concentrazione dell’elemento interagente. In modo specifico, BPb ha un’associazione significativa positiva con i problemi di attenzione quando UAs raggiunge i suoi più alti livelli di concentrazione (la solida linea nera che corrisponde a β = 0 è fuori il CI quando As è al 75° e 90° percentile). Lo stesso vale per UAs in cui possiamo vedere una tendenza simile che raggiunge un’associazione significativa con problemi di attenzione anche a livelli di BPb più bassi: il parametro β è significativamente diverso da 0 a partire dal livello di concentrazione di BPb corrispondente al valore mediana. Possiamo osservare delle tendenze simili per il comportamento aggressivo con un’associazione significativa con Pb, mentre As raggiunge significato statistico solo per un’esposizione simultanea molto alta di Pb (corrispondente al 90° percentile di BPb). I risultati per ansia e depressione, disturbi somatici, problemi sociali e comportamento di violazione delle regole, che mostrano un’associazione rispettivamente con Pb e As, sono riportati nelle Figure S1 e S2 del Materiale Supplementare.

Figura 1: L’associazione tra l’interazione di BPb e Uas con il comportamento aggressivo e i problemi di attenzione. L’associazione tra l’interazione di BPb e di UAs e il comportamento aggressivo (prima colonna) e i problemi di attenzione (seconda colonna). In ogni sezione il cambio del parametro β è rappresentato come una funzione della concentrazione di BPb (prima fila) e UAs (seconda fila). Ogni linea mostra come il coefficiente β varia su diversi livelli del metallo che interagisce (UAs per la prima fila e BPb per la seconda fila).

Quando si considerano i problemi di esternalizzazione, i problemi totali e il punteggio totale SRS e si aggiunge il termine di interazione tra BPb e UAs (Tavola 6), si osserva anche un effetto condizionale significativo sia di Pb che di As per l’aumento della concentrazione di UAs e BPb rispettivamente. BPb ha raggiunto la significatività nell’associazione con l’esternalizzazione e i problemi totali quando UAs era almeno pari al suo valore mediano. UAs ha mostrato un’associazione rilevante con i problemi di associazione quando il BPb era alto quanto il 90° percentile, con i problemi totali quando BPb era pari o maggiore del 60° percentile e con il punteggio T di SRS quando BPb ha raggiunto il 75° percentile.

Abbiamo rappresentato l’effetto dell’interazione tra BPb e UAs sul punteggio dei problemi totali di CBCL nella Figura 2, per dare una rappresentazione migliore di come l’associazione tra il risultato e i BPb e UAs sia cambiato all’aumentare dei livelli del rispettivo elemento che interagisce. Si può stimare uno schema chiaro di un impatto aumentato del metallo sui problemi totali di comportamento per livelli superiori sia dell’elemento di interesse sia del metallo che interagisce. I risultati per i problemi di esternalizzazione e il punteggio totale T di SRS sono mostrati nelle Figure S1 e S2 rispettivamente del Materiale Supplementare.

Figura 2: L’associazione dell’interazione di BPb e UAs con i problemi totali. L’associazione BPb e UAs con i problemi totali di CBCL quando un termine di interazione tra le due concentrazioni di metallo è incluso in un modello lineare a effetto misto. Il colore blu corrisponde a un basso livello di concentrazioni Pb o As mentre il rosso corrisponde ad alti livelli di concentrazione.

Discussione

Lo scopo di questo studio era di esplorare l’associazione tra l’esposizione a elementi potenzialmente neurotossici e gli esiti sul neurocomportamento. Siamo stati in grado di identificare Pb e As e la loro interazione come fattori di rischio importanti nell’aumentare la probabilità dei problemi neurocomportamentali nei bambini che vivono nella provincia di Taranto.

Sono stati rilevati l’iperattività aumentata e i tratti psicopatologici, l’invalidità del comportamento sociale e un maggiore rischio di autismo nei quartieri di Tamburi e Paolo VI, che sono localizzati a una distanza più vicina dalle emissioni industriali. Siamo stati in grado di trovare importanti differenze tra le aree di residenza considerando le valutazioni degli insegnanti rispetto a quelle dei genitori. Insieme ad una diminuzione dei punteggi neurocomportamentali ad una maggiore distanza dalla fabbrica (cioè meno problemi di comportamento nelle aree più lontane) abbiamo osservato delle tendenze negative anche per concentrazioni di elementi sotto-studiati ma non per BSe e HHg. Tuttavia, il primo elemento è noto per avere un effetto protettivo sul neurosviluppo mentre il secondo può essere sventato col consumo di pesce; l’assenza di questa informazione è un limite al presente studio.

Guardando l’associazione tra i biomarcatori e gli esiti neurocomportamentali in un modello multi-variabile, siamo stati in grado di trovare un’associazione significativa tra BPb e UAs anche regolando per SES e la distanza dalla fabbrica. BPb ha influenzato principalmente i problemi sociali, il comportamento aggressivo, l’esternalizzazione e i problemi totali. UAs ha mostrato un impatto su ansia, depressione, problemi somatici, problemi di attenzione e comportamento di violazione delle regole nonché una rilevante associazione con l’autismo (misurata attraverso il punteggio totale T di SRS). Questo è in linea con la lista di priorità delle sostanze dannose dell’EPA in US, in cui As e Pb sono classificati primi e secondi rispettivamente.

A causa dell’assenza di multicollinearità tra i metalli, sia la distribuzione deviata che la struttura multilivello delle variabili dipendenti, abbiamo optato per l’applicazione di modelli lineari a effetto misto regressioni censurate invece che i più recenti modelli misti ambientali come la regressione SQP (Somma Quantile Ponderata) o la regressione di Baynes (BKMR). Questa scelta non ci ha permesso di stimare un effetto generale tra ogni sostanza chimica e gli esiti al netto dell’esposizione ad altri elementi e di rappresentare l’interazione tra i metalli. Attraverso l’inclusione di un termine di interazione tra paia di metalli, siamo stati in grado di osservare un effetto moltiplicativo di Pb e As sul comportamento infantile. In particolare, un effetto sinergico delle due sostanze è stato evidenziato in associazione con problemi di attenzione, comportamento aggressivo, esternalizzazione e problemi totali. Il meccanismo di neurotossicità di questi due elementi è diverso perché implicano l’inibizione di alcuni elementi cellulari e l’aumento di fattori apoptotici che causano la morte delle cellule neuronali. Tuttavia, il meccanismo attraverso cui la miscela di metalli causa danno neuronale è ancora poco chiaro e necessita una maggiore esplorazione.

Attraverso questo e il precedente lavoro di Lucchini et al. 2019, siamo stati in grado di osservare un’associazione di Pb sia sul comportamento che sulla cognizione. Questi effetti diversi di Pb sono stati mostrati anche in altri studi 34,35, e sono stati associati ad alterazioni nel DNA e nell’integrità  cromosomale, all’interazione con le proteine e all’alterazione dello stato cellulare di ossidriduzione37.

La misura di biomonitoraggio non ha mostrato livelli elevati rispetto agli standard disponibili o ad altri studi di comunità simili38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52.

Ciononostante, siamo stati in grado di trovare un’associazione significativa tra l’esposizione e gli esiti. Questo risultato evidenzia l’importanza di considerare le interazioni possibili tra gli inquinanti che possono amplificare gli effetti dell’esposizione anche a livelli bassi come già segnalato da precedenti studi che hanno mostrato come l’esposizione ai metalli nello stesso momento può contribuire a un maggiore rischio di autismo29  e conseguenze comportamentali 27,28,30. Tuttavia, i nostri dati riflettono principalmente l’esposizione attuale, e non possono escludere i livelli superiori di esposizione precedenti che si sono verificati negli anni passati quando la fabbrica aveva dei livelli di produzione superiori a quelli di oggi.

Questa è un’analisi complementare allo studio precedente38 in cui abbiamo trovato un’associazione tra le esposizioni agli elementi neurotossici e alle abilità neuro-cognitive tra i bambini che vivono nella zona di Taranto. In questo studio abbiamo considerato la stessa popolazione ma ci siamo concentrati sugli aspetti neurocomportamentali. Questo studio evidenzia anche come le zone svantaggiate siano esposte ad un rischio superiore di problemi neurocomportamentali oltre al rischio di capacità neurocognitive più basse come già segnalato in Lucchini et al. 2019.

Abbiamo osservato poca concordanza tra le valutazioni dei genitori e degli insegnanti, tuttavia anche se non c’era nessuna tendenza a misurare menzogne, grazie alla disponibilità sia dei genitori sia degli insegnanti abbiamo avuto una valutazione più robusta dei problemi neurocomportamentali dei bambini a causa della percezione e dell’aspettativa diverse delle due persone intervistate. Siccome le relazioni degli insegnanti possono amplificare l’effetto delle sostanze chimiche sul comportamento  nello stesso sesso24, la valutazione doppia di genitori e insegnanti può evitare di incorrere in questa situazione.

Questo studio ha alcuni limiti: non siamo stati in grado di rappresentare il potenziale errore della selezione che potrebbe essere stato generato per il basso tasso di partecipazione; a causa della natura a sezione trasversale dello studio non possiamo attribuire un ruolo causativo agli elementi neurotossici sul comportamento infantile; il biomonitoraggio ha coperto solo l’esposizione attuale escludendo i periodi prenatali e postnatali che sono considerati finestre di esposizione vulnerabili, in particolare l’assenza di informazione sull’esposizione precedente durante i precedenti livelli superiori di produzione della fabbrica è un limite nell’identificare l’impatto che queste sostanze chimiche possono avere sulle conseguenze considerate; UAs è un marcatore di esposizione a breve termine, la indisponibilità di As nei capelli o unghie che sono biomarcatori di peso a lungo termine, è un limite; potremmo anche non considerare l’effetto che l’esposizione concorrente ad altri fattori, come i composti organici, possono avere sul neurosviluppo; nonostante avessimo regolato per diversi fattori confondenti c’era ancora dell’informazione mancante come le relazioni genitoriali; infine la misura del campione non è stata probabilmente sufficiente a rilevare interamente l’associazione dei metalli e le loro interazioni sul neurocomportamento.

In questo lavoro abbiamo scoperto che As e Pb possono influire sul comportamento del bambino a scuola aumentando il rischio di problemi neurocomportamentali e autismo e avere un effetto sinergico su alcuni problemi di comportamento infantile. Con questo studio abbiamo evidenziato l’importanza di considerare le interazioni tra gli inquinanti dato che può amplificare l’effetto dell’esposizione a livelli bassi. Più lavoro è necessario per affrontare l’effetto neurologico dell’esposizione a miscele di metalli considerando le loro interazioni.

Metodi

Area di studio e popolazione

L’area di studio, la selezione del campione e le strategia di reclutamento sono già descritte nei lavori precedenti 38,53. In breve, l’area di studio è la città di Taranto, Sud Italia, dove un grande polo industriale che include uno dei più grandi produttori di acciaio in Europa opera da molti decenni, causando le emissioni di elementi tossici e molti altri composti chimici nella zona circostante. 12 scuole elementari collocate nelle 5 sub-aree da una distanza incrementale dal polo industriale sono state selezionate dalle procedure di iscrizione.

Un totale di 700 coppie di genitori-figli è stato invitato a partecipare su base volontaria allo studio. I bambini dai 6 a 11 anni sono stati iscritti tramite il sistema scolastico pubblico secondo un approccio partecipatorio basato sulla comunità che ha coinvolto la comunità di Taranto. Gli obiettivi e la metodologia dello studio sono stati spiegati attraverso incontri ad hoc e la disponibilità di brochure per gli insegnanti, genitori e figli. 432 soggetti hanno aderito allo studio mostrando il tasso di partecipazione al 62%. Si è ottenuto il consenso informato da tutti i genitori. I soggetti che hanno aderito hanno compilato un questionario di selezione per la valutazione dei criteri di inclusione che erano nati e cresciuti nelle zone target dello studio, e avendo avuto l’intera gravidanza della madre nella stessa area al tempo del reclutamento, e i criteri di esclusione: la familiarità delle malattie neurodegenerative, la diagnosi/cura delle malattie neurologiche e psichiatriche, malattie epatiche e biliari, malattie dismetaboliche, disturbi endocrini, disturbi al rene, alimentazione precedente dei genitori e difetti visivi non corretti. In tutto 299 bambini hanno corrisposto i criteri di inclusione raggiungendo la misura di campione minima stimata dal calcolo di potenza dove l’effetto dei 6 metalli era considerato su conseguenze cognitive ipotizzando intorno al 1.4 % la spiegazione della variabilità dell’esito per ogni elemento basato su uno studio precedente e consentendo le interazioni e dei test multipli ma non considerando gli strati; in particolare, per ogni scuola una media di 27 studenti è stata reclutata da un minimo di 16 a un massimo di 56. La progettazione dello studio, l’informazione sugli scopi della ricerca e i moduli per il consenso informato sono state revisionate e approvate dalle commissioni etiche dell’Agenzia Pubblica Sanitaria di Brindisi. Tutti i metodi sono stati adottati nel rispetto delle linee guida e dei regolamenti.

Il biomonitoraggio degli elementi

I campioni di sangue, urina e capelli sono stati raccolti nelle scuole il giorno prima delle prove neuropsicologiche. La spettrometria di massa a plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS) (Elementll, Thermo Scientific, Brema, Germania) è stata usata per le misure in BPb e BSe, in UAs e nelle urine Cd (UCd), e nei capelli Mn (HMn) 54,55. In aggiunta, HHg è stato quantificato dalla spettrometria assorbimento atomico dell’amalgamazione per decomposizione termica (TDA-AAS) usando un Direct Mercury Analyzer (DMA-80 TRICELL, FKV, Bergamo, Italy) 56. Il sangue e le urine sono stati refrigerati a – 20°. Entrambe le procedure analitiche sono state estensivamente descritte in studi precedenti, inclusi gli aspetti sul controllo della qualità, in Ruggieri et al. 2016 e Alimonti et al. 2015 per ICP-MS e Domanico et al. 2017 per le analisi DMA.

Valutazione psicologica, sondaggio degli adulti sui bambini

La valutazione neuropsicologica è stata condotta da quattro neuropsichiatri che hanno adottato un’intercalibrazione periodica per la procedura della prova e del punteggio. La Checklist sul Comportamento Infantile (CBCL), somministrata alla principale insegnante e alle madri57, è stata considerata per identificare i problemi comportamentali dei bambini. Questo test misura otto scale di sindrome basate empiricamente: Comportamento Aggressivo, Ansia/Depressione, Problemi dell’Attenzione, Comportamento di violazione delle regole, Disturbi somatici, Problemi Sociali, Problemi di pensiero, Introversione/Depressione. Tutte queste scale possono essere combinate nei punteggi di problemi di Internalizzazione e problemi di Esternalizzazione che possono essere sintetizzati a loro volta in punteggio di problema Totale. Anche le scale orientate del Manuale di Diagnostica e Statistica dei Disturbi Mentali (DSM) sono state considerate: Problemi Affettivi, Problemi d’Ansia, Problemi Somatici, Problemi ADHD, Problemi di Disordine Ribelle Oppositivo, Problemi di Condotta. La Social Responsiveness Scale (SRS) 58 è stata somministrata per misurare tratti autistici come osservati dalla principale insegnante e dalla madre con un sondaggio di 65 domande. Sia per la CBCL che per SRS un punteggio più basso significa meno problemi comportamentali.

Valutazione psicologica, performance del bambino

Anche la Wechsler Intelligence Scale per i bambini edizione IV (WISC-IV) 59 (la versione italiana dell’edizione più recente non è ancora disponibile) per la valutazione cognitiva dei bambini è stata presa dei partecipanti.

Dati sociodemografici e sullo stile di vita

I dati sociodemografici che includono l’età, il sesso, SES, l’area di residenza e la distanza dalla fonte sono stati raccolti dai partecipanti attraverso la somministrazione dei questionari ai genitori. L’età dei genitori, il livello d’istruzione, il livello di occupazione e la percezione dello stress causato dal lavoro sono stati considerati per categorizzare ogni soggetto in tre livelli di istruzione e occupazione (basso, medio e alto) attraverso la di cui combinazione è stata costruita una variabile SES con molti livelli60. La distanza dalla fonte è stata misurata come la distanza dal più vicino punto del poligono che delimita il sito industriale responsabile della maggior parte delle emissioni. Anche le informazioni sullo stile di vita sono state raccolte come l’esposizione al fumo passivo e lo stimolo cognitivo via il questionario HOME (Osservazione della casa per la misura dell’ambiente)61.

Analisi statistica

Le statistiche descrittive sono state riportate per tutte le variabili di interesse per la misura del campione totale stratificate per area di residenza (Tamburi, Statte, Paolo VI, Taranto, Talsano). Le frequenze e le proporzioni sono state usate per le variabili categoriche, la mediana e la gamma di interquartili per le variabili continue. Il confronto preliminare tra i sub-siti dello studio è stato eseguito con il test non-parametrico basato sui ranghi di Kruskal-Wallis. La correlazione tra le concentrazioni di metallo è stata misurata con il coefficiente di correlazione di Spearman.

Le statistiche dei biomarcatori sono state riportate in Lucchini et al.38: mediana, primo e terzo quartile sono esposti vicino al coefficiente di regressione lineare e gli intervalli di confidenza al 95% (CI) relativo all’associazione tra la distanza alla fonte di emissione e i biomarcatori dopo aver trasformato le concentrazioni di metallo per ottenere una distribuzione normale e dopo aver applicato le spline cubiche alla distanza dalla fonte per valutare una tendenza lineare.

L’omogeneità tra i punteggi dei genitori e degli insegnanti è stata definita attraverso il coefficiente di correlazione intraclasse (ICC). Dopo aver controllato l’asimmetria e la curtosi di ogni esito neurocomportamentale, l’associazione tra esposizione a elementi multipli e le scale di sindrome combinate (internalizzazione, esternalizzazione e problemi totali) e i punteggi SRS è stata testata con un modello lineare a effetti misti permettendo di considerare sia i punteggi dei genitori che degli insegnanti con i partecipanti, la scuola e l’area di residenza considerati come effetti casuali con una struttura impilata. Una regressione censurata62 è stata applicata al livello più basso della sindrome basata empiricamente e le scale orientate DSM a casua dei dati censurati e asimmetrici (il punteggio è incluso tra 50 e 100 e c’è stato un punto di massa al limite più basso). Le stime solide degli errori standard raggruppate per soggetti sono state considerate permettendo di includere entrambi i punteggi ottenuti dai questionari compilati dai genitori e dagli insegnanti. Per la regressione censurata abbiamo riportato un effetto marginale (gli effetti sulle vere e proprie variabili dipendenti limitate) al valore medio delle covariate visto che la significatività non è cambiata sia per i più bassi che per i più alti valori. La multicollinearità è stata valutata in modelli multivariabili attraverso il fattore di inflazione della varianza (VIF) mentre la correlazione semiparziale è stata stimata per definire quale variabile spiegava la più alta proporzione di varianza per ogni esito. Un termine d’interazione tra le paia di metallo è stato introdotto (come il prodotto dei due metalli considerati) nei modelli lineari a effetti misti e le regressioni censurate. L’effetto marginale di ogni elemento all’aumentare del livello della sostanza chimica interagente è stato mostrato in entrambi i modelli. In particolare, per il modello lineare a effetti misti abbiamo riportato l’effetto totale di ogni metallo sull’esito considerato ai diversi livelli di concentrazione dell’elemento interagente. Nel caso della regressione censurata, visto che il parametro non solo cambia a livelli diversi della variabile con cui interagisce (grazie al termine di interazione) ma anche con la variazione della variabile con cui è associata (quando si considerano gli effetti marginali), abbiamo rappresentato i parametri β con il loro 95% CI come una variabile dipendente del metallo con cui è associata e ai diversi livelli dell’elemento interagente.

Abbiamo incluso nelle analisi i valori < LOD (Limite di Rilevazione) (questi erano 1.6% dei risultati, solo per UCd) per non perdere il potere statistico.

Tutti i modelli sono stati aggiustati per sesso, età. SES, distanza dalla fonte di esposizione, quoziente intellettivo del bambino, esposizione al fumo passivo e il punteggio totale HOME come potenziali confondenti. Tutti i test statistici sono stati a due lati e hanno assunto un livello di significatività del 5% dopo aver applicato i valori p aggiustati di Hochberg per spiegare i test multipli per il test di Kruskal Wallis, mentre l’aggiustamento di Tukey è stato considerato per gli effetti marginali. Tutte le analisi sono state eseguite con R 4.0.2 63 e Stata 15 64.

Approvazione etica e consenso a partecipare

Questo studio ha ottenuto l’approvazione della Commissione Etica dell’ASL di Brindisi, con la giurisdizione della provincia di Taranto.

Disponibilità dei dati

I dataset generati e analizzati durante il presente studio sono disponibili dall’autore corrispondenti su richiesta ragionevole.

Qui puoi scaricare la pubblicazione scientifica integrale

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Referenze
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